Teor de péptido versus pureza: o que está no frasco
Um frasco de 5 mg não contém 5 mg de péptido. Contra-iões e água residual compõem o resto, e em trabalho quantitativo isso importa.
Um frasco rotulado como 5 mg não contém 5 mg de péptido. Contém 5 mg de material liofilizado, do qual o péptido é uma fração — tipicamente 70 a 90 por cento. Em trabalho qualitativo raramente importa. Em qualquer trabalho quantitativo é a diferença entre um resultado e um artefacto.
O que mais existe no frasco
Três coisas partilham a massa com o péptido:
- Contra-iões. Os péptidos são purificados por HPLC de fase reversa com ácido trifluoroacético, e saem dessa coluna como sais de TFA. Cada resíduo básico — lisina, arginina, histidina — pode ter um contra-ião. Numa sequência rica neles, só o TFA pode representar 10 a 20 por cento da massa.
- Água residual. A liofilização remove a maior parte da água, não toda. Costuma ficar uma pequena percentagem ligada, e aumenta se um frasco tiver sido aberto a frio e captado humidade.
- Solvente residual e sais da purificação, normalmente uma contribuição menor.
Porquê TFA em concreto
O trifluoroacetato é o agente padrão de emparelhamento iónico na purificação de péptidos porque dá picos estreitos e evapora com facilidade. A contrapartida é que fica ligado ao péptido, e não é inerte: o TFA tem efeitos documentados em cultura celular a concentrações que podem ser atingidas apenas por dissolver um péptido na forma de sal de TFA.
Por isso existe material trocado para acetato e por isso custa mais. Se um protocolo envolve células e é sensível, convém conhecer o contra-ião em vez de o assumir.
Como se mede o teor de péptido
Nos certificados aparecem dois métodos:
- Análise de aminoácidos (AAA) — o material é hidrolisado a aminoácidos livres e quantificado. É o método de referência e dá um valor absoluto.
- Determinação de azoto — mede-se o azoto total e recalcula-se a partir da sequência. Mais barato, um pouco menos específico.
Nenhum equivale à pureza por HPLC, e é essa distinção que causa a maior parte da confusão. A pureza é uma proporção; o teor é uma massa. Uma amostra pode ser 99 por cento pura e 80 por cento péptido em massa ao mesmo tempo, sem contradição — os 99 por cento descrevem que fração do material peptídico é a sequência-alvo, e os 75 por cento que fração do pó é sequer péptido.
O que significa na prática
| Rótulo | 5 mg de liofilizado |
|---|---|
| Pureza por HPLC | 99 % |
| Teor de péptido | 80 % |
| Péptido real | ~4 mg |
| Concentração em 2 ml | ~2 mg/ml, não 2,5 |
Um erro de 20 por cento na concentração chega e sobra para deslocar uma curva dose-resposta. Se o estudo for quantitativo, pedir o teor de péptido e calcular a partir desse valor e não do rótulo.
O que perguntar a um fornecedor
- O certificado indica o teor de péptido além da pureza por HPLC?
- O material é sal de TFA ou de acetato?
- O teor foi medido por análise de aminoácidos ou por azoto?
Um fornecedor que não consiga responder à primeira pergunta está a citar um número que não mediu. O nosso guia do certificado cobre o que mais deve constar do documento, e a calculadora de reconstituição trata dos cálculos assim que tiver o valor real.
Cada lote que fornecemos é analisado por um laboratório independente quanto a pureza por HPLC e identidade por espetrometria de massa, com certificados associados ao lote mediante pedido.
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