Obsah peptidu versus čistota: co je ve vialce
5mg vialka neobsahuje 5 mg peptidu. Protiionty a zbytková voda tvoří zbytek a u kvantitativní práce na tom záleží.
Vialka označená 5 mg neobsahuje 5 mg peptidu. Obsahuje 5 mg lyofilizovaného materiálu, z něhož je peptid jen částí — typicky 70 až 90 procent. U kvalitativní práce to zřídka vadí. U čehokoli kvantitativního je to rozdíl mezi výsledkem a artefaktem.
Co dalšího je ve vialce
O hmotnost se s peptidem dělí tři věci:
- Protiionty. Peptidy se purifikují reverzně-fázovou HPLC s kyselinou trifluoroctovou a z té kolony odcházejí jako TFA soli. Každý bazický zbytek — lysin, arginin, histidin — může nést protiiont. U sekvence bohaté na ně může samotná TFA tvořit 10 až 20 procent hmotnosti.
- Zbytková voda. Lyofilizace odstraní většinu vody, ne všechnu. Pár procent obvykle zůstává vázaných a přibývá, pokud se vialka otevřela za studena a nasála vlhkost.
- Zbytkové rozpouštědlo a soli z purifikace, obvykle menší příspěvek.
Proč právě TFA
Trifluoracetát je standardním párovacím činidlem při purifikaci peptidů, protože dává ostré píky a ochotně se odpařuje. Kompromisem je, že zůstává vázán na peptid a není inertní: TFA má zdokumentované účinky v buněčné kultuře při koncentracích, kterých lze dosáhnout prostým rozpuštěním peptidu ve formě TFA soli.
Proto existuje materiál s vyměněným acetátem a proto stojí víc. Zahrnuje-li protokol buňky a je citlivý, protiiont se vyplatí vědět, ne předpokládat.
Jak se měří obsah peptidu
Na certifikátech se objevují dvě metody:
- Aminokyselinová analýza (AAA) — materiál se hydrolyzuje na volné aminokyseliny a kvantifikuje. Jde o referenční metodu dávající absolutní hodnotu.
- Stanovení dusíku — měří se celkový dusík a zpětně přepočítá ze sekvence. Levnější, o něco méně specifické.
Ani jedno není totéž co HPLC čistota a právě tento rozdíl způsobuje většinu zmatku. Čistota je poměr; obsah je hmotnost. Vzorek může být současně 99% čistý a 80% peptidový hmotnostně, bez jakéhokoli rozporu — 99 % popisuje, jaký podíl peptidového materiálu je cílová sekvence, a 75 % popisuje, jaký podíl prášku je vůbec peptid.
Co to znamená v praxi
| Etiketa | 5 mg lyofilizátu |
|---|---|
| HPLC čistota | 99 % |
| Obsah peptidu | 80 % |
| Skutečný peptid | ~4 mg |
| Koncentrace ve 2 ml | ~2 mg/ml, ne 2,5 |
20% chyba v koncentraci bohatě stačí k posunu křivky dávka–odpověď. Je-li studie kvantitativní, vyžádej si obsah peptidu a počítej z této hodnoty, ne z etikety.
Co se zeptat dodavatele
- Uvádí certifikát kromě HPLC čistoty i obsah peptidu?
- Je materiál TFA sůl nebo acetátová sůl?
- Byl obsah měřen aminokyselinovou analýzou nebo přes dusík?
Dodavatel, který neumí odpovědět na první otázku, uvádí číslo, které nezměřil. Náš průvodce certifikátem pokrývá, co dalšího na dokument patří, a kalkulačka rekonstituce zvládne výpočty, máš-li skutečnou hodnotu.
Každou šarži, kterou dodáváme, analyzuje nezávislá laboratoř na HPLC čistotu a hmotnostně-spektrometrickou identitu, s certifikáty přiřazenými k šarži na vyžádání.
All products and information referenced are for in-vitro research and laboratory use only. Nothing here is medical advice, and no therapeutic claim is made or implied.