Obsah peptidu verzus čistota: čo je vo fľaštičke
5 mg fľaštička neobsahuje 5 mg peptidu. Protiióny a zvyšková voda tvoria zvyšok a pri kvantitatívnej práci na tom záleží.
Fľaštička označená 5 mg neobsahuje 5 mg peptidu. Obsahuje 5 mg lyofilizovaného materiálu, z ktorého je peptid len časťou — typicky 70 až 90 percent. Pri kvalitatívnej práci to zriedka vadí. Pri čomkoľvek kvantitatívnom je to rozdiel medzi výsledkom a artefaktom.
Čo ešte je vo fľaštičke
O hmotnosť sa s peptidom delia tri veci:
- Protiióny. Peptidy sa purifikujú reverzno-fázovou HPLC s kyselinou trifluóroctovou a z tej kolóny odchádzajú ako TFA soli. Každý bázický zvyšok — lyzín, arginín, histidín — môže niesť protiión. Pri sekvencii bohatej na ne môže samotná TFA tvoriť 10 až 20 percent hmotnosti.
- Zvyšková voda. Lyofilizácia odstráni väčšinu vody, nie všetku. Pár percent zvyčajne zostáva viazaných a pribúda, ak sa fľaštička otvorila za studena a nasala vlhkosť.
- Zvyškové rozpúšťadlo a soli z purifikácie, zvyčajne menší príspevok.
Prečo práve TFA
Trifluóracetát je štandardným párovacím činidlom pri purifikácii peptidov, lebo dáva ostré píky a ochotne sa odparuje. Kompromisom je, že zostáva viazaný na peptid a nie je inertný: TFA má zdokumentované účinky v bunkovej kultúre pri koncentráciách, ktoré sa dajú dosiahnuť jednoduchým rozpustením peptidu vo forme TFA soli.
Preto existuje materiál s vymeneným acetátom a preto stojí viac. Ak protokol zahŕňa bunky a je citlivý, protiión sa oplatí vedieť, nie predpokladať.
Ako sa meria obsah peptidu
Na certifikátoch sa objavujú dve metódy:
- Aminokyselinová analýza (AAA) — materiál sa hydrolyzuje na voľné aminokyseliny a kvantifikuje. Ide o referenčnú metódu dávajúcu absolútnu hodnotu.
- Stanovenie dusíka — meria sa celkový dusík a spätne prepočíta zo sekvencie. Lacnejšie, o niečo menej špecifické.
Ani jedno nie je to isté ako HPLC čistota a práve tento rozdiel spôsobuje väčšinu zmätku. Čistota je pomer; obsah je hmotnosť. Vzorka môže byť súčasne 99 % čistá a 80 % peptidová hmotnostne, bez akéhokoľvek rozporu — 99 % opisuje, aký podiel peptidového materiálu je cieľová sekvencia, a 75 % opisuje, aký podiel prášku je vôbec peptid.
Čo to znamená v praxi
| Etiketa | 5 mg lyofilizátu |
|---|---|
| HPLC čistota | 99 % |
| Obsah peptidu | 80 % |
| Skutočný peptid | ~4 mg |
| Koncentrácia v 2 ml | ~2 mg/ml, nie 2,5 |
20 % chyba v koncentrácii bohato stačí na posun krivky dávka–odpoveď. Ak je štúdia kvantitatívna, pýtaj si obsah peptidu a počítaj z tejto hodnoty, nie z etikety.
Čo sa opýtať dodávateľa
- Uvádza certifikát okrem HPLC čistoty aj obsah peptidu?
- Je materiál TFA soľ alebo acetátová soľ?
- Bol obsah meraný aminokyselinovou analýzou alebo cez dusík?
Dodávateľ, ktorý nevie odpovedať na prvú otázku, uvádza číslo, ktoré nezmeral. Náš sprievodca certifikátom pokrýva, čo ešte na dokument patrí, a kalkulačka rekonštitúcie zvládne výpočty, keď máš skutočnú hodnotu.
Každú šaržu, ktorú dodávame, analyzuje nezávislé laboratórium na HPLC čistotu a hmotnostno-spektrometrickú identitu, s certifikátmi priradenými k šarži na požiadanie.
Všetky uvádzané produkty a informácie sú určené výhradne na in-vitro výskum a laboratórne použitie. Nič z uvedeného nie je lekárska rada a nepredstavuje ani nenaznačuje žiadne terapeutické tvrdenie.