Sadržaj peptida i čistoća: dvije različite brojke
Uzorak može istodobno biti 99 posto čist i 75 posto peptida po masi. Čistoća je omjer, sadržaj je masa.
Bočica označena s 5 mg ne sadrži 5 mg peptida. Sadrži 5 mg liofiliziranog materijala, od kojega je peptid samo dio — obično 70 do 90 posto. Za kvalitativni rad to rijetko išta mijenja. Za bilo što kvantitativno to je razlika između rezultata i artefakta.
Što je još u bočici
Masu s peptidom dijele tri stvari:
- Protuioni. Peptidi se pročišćavaju HPLC-om obrnutih faza uz trifluoroctenu kiselinu i s te kolone silaze kao TFA soli. Svaki bazični ostatak — lizin, arginin, histidin — može nositi protuion. Kod sekvence bogate njima sam TFA može činiti 10 do 20 posto mase.
- Zaostala voda. Liofilizacija uklanja većinu vode, ne svu. Nekoliko posto obično ostaje vezano, a udio raste ako je bočica otvorena hladna i povukla vlagu.
- Zaostalo otapalo i soli iz pročišćavanja, obično manji doprinos.
Zašto baš TFA
Trifluoroacetat je standardno sredstvo za sparivanje iona u pročišćavanju peptida jer daje oštre vrhove i lako isparava. Cijena je to što ostaje vezan uz peptid i nije inertan: TFA ima dokumentirane učinke u staničnoj kulturi pri koncentracijama koje se postižu jednostavnim otapanjem peptida u obliku TFA soli.
Zato postoji materijal s izmijenjenim acetatom i zato košta više. Ako protokol uključuje stanice i osjetljiv je, protuion vrijedi znati, a ne pretpostavljati.
Kako se mjeri sadržaj peptida
Na certifikatima se pojavljuju dvije metode:
- Analiza aminokiselina (AAA) — materijal se hidrolizira do slobodnih aminokiselina i kvantificira. To je referentna metoda i daje apsolutnu vrijednost.
- Određivanje dušika — mjeri se ukupni dušik i preračunava natrag iz sekvence. Jeftinije, nešto manje specifično.
Nijedna nije isto što i HPLC čistoća, i upravo ta razlika izaziva najviše zabune. Čistoća je omjer; sadržaj je masa. Uzorak može istodobno biti 99 posto čist i 75 posto peptida po masi, bez ikakve proturječnosti — 99 posto opisuje koji je udio prisutnog peptidnog materijala ciljna sekvenca, a 75 posto koji je udio praha uopće peptid.
Što to znači u praksi
| Oznaka | 5 mg liofilizata |
|---|---|
| HPLC čistoća | 99 % |
| Sadržaj peptida | 80 % |
| Stvarni peptid | ~4 mg |
| Koncentracija u 2 ml | ~2 mg/ml, ne 2,5 |
Pogreška od 20 posto u koncentraciji više je nego dovoljna da pomakne krivulju doza-odgovor. Ako je studija kvantitativna, tražite sadržaj peptida i računajte iz te brojke, a ne s oznake.
Što pitati dobavljača
- Navodi li certifikat sadržaj peptida uz HPLC čistoću?
- Je li materijal TFA sol ili acetatna sol?
- Je li sadržaj mjeren analizom aminokiselina ili dušikom?
Dobavljač koji ne može odgovoriti na prvo pitanje navodi broj koji nije izmjerio. Naš vodič za certifikat pokriva što još pripada u dokument, a kalkulator rekonstitucije aritmetiku kada imate pravu brojku.
Svaku šaržu koju isporučujemo analizira neovisni laboratorij na HPLC čistoću i identitet masenom spektrometrijom, a certifikati vezani uz šaržu dostupni su na zahtjev.
All products and information referenced are for in-vitro research and laboratory use only. Nothing here is medical advice, and no therapeutic claim is made or implied.