Zawartość peptydu a czystość: dwie różne liczby
Próbka może być jednocześnie w 99 procentach czysta i w 75 procentach masy peptydowa. Czystość to stosunek, zawartość to masa.
Fiolka z etykietą 5 mg nie zawiera 5 mg peptydu. Zawiera 5 mg materiału liofilizowanego, którego peptyd stanowi ułamek — zwykle 70 do 90 procent. Przy pracy jakościowej rzadko ma to znaczenie. Przy czymkolwiek ilościowym to różnica między wynikiem a artefaktem.
Co jeszcze jest w fiolce
Masę dzielą z peptydem trzy rzeczy:
- Przeciwjony. Peptydy oczyszcza się HPLC w odwróconym układzie faz z użyciem kwasu trifluorooctowego i schodzą z tej kolumny jako sole TFA. Każda reszta zasadowa — lizyna, arginina, histydyna — może nieść przeciwjon. Przy sekwencji w nie bogatej sam TFA może odpowiadać za 10 do 20 procent masy.
- Woda resztkowa. Liofilizacja usuwa większość wody, nie całą. Kilka procent zwykle zostaje związane, a udział rośnie, jeśli fiolkę otwarto zimną i wciągnęła wilgoć.
- Resztkowy rozpuszczalnik i sole z oczyszczania, zwykle mniejszy wkład.
Dlaczego akurat TFA
Trifluorooctan jest standardowym czynnikiem parującym jony w oczyszczaniu peptydów, bo daje ostre piki i łatwo odparowuje. Ceną jest to, że zostaje związany z peptydem i nie jest obojętny: TFA ma udokumentowany wpływ na hodowlę komórkową w stężeniach osiągalnych po prostu przez rozpuszczenie peptydu w postaci soli TFA.
Dlatego istnieje materiał z wymianą na octan i dlatego kosztuje więcej. Jeśli protokół dotyczy komórek i jest wrażliwy, przeciwjon warto znać, a nie zakładać.
Jak mierzy się zawartość peptydu
Na certyfikatach pojawiają się dwie metody:
- Analiza aminokwasowa (AAA) — materiał hydrolizuje się do wolnych aminokwasów i oznacza ilościowo. To metoda referencyjna, dająca wartość bezwzględną.
- Oznaczenie azotu — mierzy się azot całkowity i przelicza wstecz z sekwencji. Tańsze, nieco mniej swoiste.
Żadna z nich nie jest tym samym co czystość HPLC i to właśnie to rozróżnienie wywołuje najwięcej nieporozumień. Czystość to stosunek; zawartość to masa. Próbka może być jednocześnie w 99 procentach czysta i w 75 procentach masy peptydowa, bez żadnej sprzeczności — 99 procent opisuje, jaki ułamek obecnego materiału peptydowego stanowi sekwencja docelowa, a 75 procent, jaki ułamek proszku w ogóle jest peptydem.
Co to znaczy w praktyce
| Etykieta | 5 mg liofilizatu |
|---|---|
| Czystość HPLC | 99 % |
| Zawartość peptydu | 80 % |
| Rzeczywisty peptyd | ~4 mg |
| Stężenie w 2 ml | ~2 mg/ml, a nie 2,5 |
Dwudziestoprocentowy błąd stężenia w zupełności wystarczy, by przesunąć krzywą dawka–odpowiedź. Jeśli badanie jest ilościowe, poproś o zawartość peptydu i licz z tej wartości, a nie z etykiety.
O co zapytać dostawcę
- Czy certyfikat podaje zawartość peptydu obok czystości HPLC?
- Czy materiał jest solą TFA, czy solą octanową?
- Czy zawartość zmierzono analizą aminokwasową, czy metodą azotową?
Dostawca, który nie potrafi odpowiedzieć na pierwsze pytanie, podaje liczbę, której nie zmierzył. Nasz przewodnik po certyfikacie omawia, co jeszcze należy do dokumentu, a kalkulator rekonstytucji zajmuje się arytmetyką, gdy masz już prawdziwą liczbę.
Każdą dostarczaną przez nas szarżę analizuje niezależne laboratorium pod kątem czystości HPLC i tożsamości metodą spektrometrii mas, a certyfikaty przypisane do szarży są dostępne na życzenie.
All products and information referenced are for in-vitro research and laboratory use only. Nothing here is medical advice, and no therapeutic claim is made or implied.