Ein Peptid, das sich nicht lösen will: Fehlersuche der Reihe nach
Fast immer eine von vier Ursachen. Sie der Reihe nach durchzugehen löst es, ohne zu Lösungsmitteln zu greifen, die neue Probleme schaffen.
Ein Peptid, das sich nicht lösen will, ist das häufigste praktische Problem im Labor, und es ist fast immer eine von vier Ursachen. Sie der Reihe nach durchzugehen löst es, ohne zu Lösungsmitteln zu greifen, die neue Probleme schaffen.
Zuerst: löst es sich wirklich nicht?
Zeit geben. Das vollständige Lösen eines lyophilisierten Kuchens kann mehrere Minuten Stehen mit gelegentlichem sanften Schwenken brauchen. Ein Kuchen, der sich nach neunzig Sekunden nicht gelöst hat, ist noch kein Problem.
Nicht durch Schütteln oder Vortexen beschleunigen. Scherkräfte und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächen verursachen Aggregation, und ein aggregiertes Peptid löst sich tatsächlich nie mehr — man hätte ein Wartproblem in ein dauerhaftes verwandelt.
Ursache 1: Der pH liegt am isoelektrischen Punkt
Mit Abstand die häufigste. An seinem pI trägt ein Peptid keine Nettoladung, die elektrostatische Abstoßung, die Moleküle auseinanderhält, verschwindet, und die Löslichkeit erreicht ihr Minimum.
Die wahrscheinliche Richtung aus der Sequenz ableiten:
| Sequenzzusammensetzung | Wahrscheinlicher pI | Versuchen |
|---|---|---|
| Überwiegend basisch — K, R, H | Hoch | Verdünnte Essigsäure (0,1–1 %) |
| Überwiegend sauer — D, E | Niedrig | Verdünntes Ammoniumhydroxid oder Ammoniumbicarbonat |
| Gemischt oder neutral | Nahe neutral | Wasser reicht meist |
Das Minimum zugeben, das wirkt, und dann mit Wasser auf das Endvolumen verdünnen. Konzentrierte Säure oder Base direkt zuzugeben erzeugt lokale Extreme, die das Peptid schädigen, auch wenn der Endwert stimmt.
Ursache 2: Es ist hydrophob
Eine Sequenz mit hohem Anteil an I, L, V, F, W, M oder A löst sich womöglich bei keinem pH in Wasser, weil nicht genug geladene Oberfläche vorhanden ist, um sie solvatisiert zu halten.
Der Standardweg ist, in einem minimalen Volumen organischen Lösungsmittels zu lösen und dann in den wässrigen Puffer zu verdünnen:
- DMSO — am wirksamsten und am störendsten. Die Endkonzentration niedrig halten; über etwa 0,5 Prozent ist es in den meisten Zellsystemen zytotoxisch.
- Acetonitril oder Isopropanol — schonender, weniger wirksam.
- Langsam unter Schwenken in die wässrige Phase verdünnen, nie umgekehrt. Wasser zu einer konzentrierten organischen Lösung zu geben fällt das Peptid aus.
Ursache 3: Die Konzentration ist zu hoch
Löslichkeit ist endlich. Ein Peptid, das sich bei 1 mg/ml löst, muss es bei 10 nicht tun, und ein kleines Lösungsmittelvolumen der Rechnung zuliebe zu wählen ist ein gängiger Weg, über die Grenze zu geraten.
Die Abhilfe ist schlicht mehr Lösungsmittel. Das Volumen nach dem Peptid wählen, nicht nach der Rechnung.
Ursache 4: Es ist bereits aggregiert
Wurde das Fläschchen geschüttelt, mehrfach eingefroren oder schlecht gelagert, kann Aggregation bereits eingetreten sein. Aggregate sind in der Regel irreversibel: Ultraschall und Wärme scheinen zu helfen, indem sie große Partikel in kleinere zerlegen, stellen aber den nativen Zustand nicht wieder her und richten weiteren Schaden an.
Das ist der Fall, in dem die ehrliche Antwort lautet, dass das Material kompromittiert ist.
Die Reihenfolge
- Warten, sanft schwenken. Mehrere Minuten.
- Mehr Wasser zugeben — die Konzentration halbieren.
- Den pH weg vom pI verschieben, in die von der Sequenz angezeigte Richtung, mit dem Minimum an Säure oder Base.
- Ist die Sequenz stark hydrophob, in minimalem DMSO lösen und ausverdünnen.
- Aufhören. Alles darüber hinaus schadet dem Peptid mehr, als es hilft.
Unser Artikel zu pH und Löslichkeit behandelt die zugrunde liegende Chemie, die Rekonstitutionsanleitung das Standardvorgehen und der Aggregationsartikel das, was von vornherein zu vermeiden ist.
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