Peptid, ktorý sa nechce rozpustiť: riešenie v poradí
Takmer vždy ide o jednu zo štyroch príčin. Prejsť ich v poradí problém vyrieši bez siahnutia po rozpúšťadlách, ktoré vytvárajú nové.
Peptid, ktorý sa nechce rozpustiť, je najčastejším praktickým problémom v laboratóriu a takmer vždy ide o jednu zo štyroch príčin. Prejsť ich v poradí problém vyrieši bez siahnutia po rozpúšťadlách, ktoré vytvárajú nové problémy.
Najprv: naozaj sa nerozpúšťa?
Daj tomu čas. Úplné rozpustenie lyofilizovaného koláčika môže trvať niekoľko minút státia s občasným jemným krúžením. Koláčik, ktorý sa nerozpustil za deväťdesiat sekúnd, ešte nie je problém.
Neurýchľuj to trasením ani vortexovaním. Šmykové napätie a rozhrania vzduch–kvapalina spôsobujú agregáciu a zagregovaný peptid sa skutočne nikdy nerozpustí — z problému na počkanie by si urobil trvalý.
Príčina 1: pH je na izoelektrickom bode
Zďaleka najčastejšia. Pri svojom pI nenesie peptid žiadny čistý náboj, elektrostatické odpudzovanie držiace molekuly od seba zmizne a rozpustnosť dosiahne minimum.
Pravdepodobný smer odvoď zo sekvencie:
| Zloženie sekvencie | Pravdepodobné pI | Skús |
|---|---|---|
| Prevažne bázické — K, R, H | Vysoké | Zriedená kyselina octová (0,1–1 %) |
| Prevažne kyslé — D, E | Nízke | Zriedený hydroxid amónny alebo hydrogénuhličitan amónny |
| Zmiešané alebo neutrálne | Blízko neutrálneho | Voda zvyčajne funguje |
Pridaj minimum, ktoré funguje, a potom dorieď vodou na finálny objem. Pridanie koncentrovanej kyseliny alebo zásady priamo vytvára lokálne extrémy, ktoré peptid poškodia, aj keď je finálna hodnota v poriadku.
Príčina 2: je hydrofóbny
Sekvencia s vysokým podielom I, L, V, F, W, M alebo A sa nemusí rozpustiť vo vode pri žiadnom pH, lebo nie je dosť nabitého povrchu na udržanie solvatácie.
Štandardným postupom je rozpustiť v minimálnom objeme organického rozpúšťadla a potom doriediť do vodného pufra:
- DMSO — najúčinnejšie a najrušivejšie. Drž finálnu koncentráciu nízko; nad približne 0,5 % je vo väčšine bunkových systémov cytotoxický.
- Acetonitril alebo izopropanol — šetrnejšie, menej účinné.
- Rieď do vodnej fázy pomaly s krúžením, nikdy naopak. Pridanie vody do koncentrovaného organického roztoku spôsobí vyzrážanie peptidu.
Príčina 3: koncentrácia je príliš vysoká
Rozpustnosť je konečná. Peptid rozpustný pri 1 mg/ml nemusí byť pri 10 a voľba malého objemu rozpúšťadla pre jednoduchosť výpočtu je bežným spôsobom, ako sa dostať nad limit.
Riešením je jednoducho viac rozpúšťadla. Objem voľ podľa peptidu, nie podľa matematiky.
Príčina 4: už zagregoval
Ak sa fľaštičkou triaslo, opakovane mrazila alebo zle skladovala, agregácia už mohla nastať. Agregáty sú vo všeobecnosti nezvratné: sonikácia a teplo môžu zdanlivo pomôcť rozbitím veľkých častíc na menšie, ale natívny stav neobnovia a spôsobia ďalšie poškodenie.
Toto je prípad, kde je poctivou odpoveďou, že materiál je znehodnotený.
Poradie, v ktorom postupovať
- Počkaj, jemne krúž. Niekoľko minút.
- Pridaj viac vody — zníž koncentráciu na polovicu.
- Posuň pH preč od pI, smerom, ktorý naznačuje sekvencia, s minimom kyseliny alebo zásady.
- Ak je sekvencia silne hydrofóbna, rozpusti v minime DMSO a dorieď.
- Skonči. Čokoľvek nad rámec toho peptid poškodí viac, než pomôže.
Náš článok o pH a rozpustnosti pokrýva chémiu v pozadí, návod na rekonštitúciu štandardný postup a článok o agregácii to, čomu sa vyhnúť už na začiatku.
Všetky uvádzané produkty a informácie sú určené výhradne na in-vitro výskum a laboratórne použitie. Nič z uvedeného nie je lekárska rada a nepredstavuje ani nenaznačuje žiadne terapeutické tvrdenie.