Peptid, který se nechce rozpustit: řešení v pořadí
Téměř vždy jde o jednu ze čtyř příčin. Projít je v pořadí problém vyřeší bez sáhnutí po rozpouštědlech, která vytvářejí nová.
Peptid, který se nechce rozpustit, je nejčastějším praktickým problémem v laboratoři a téměř vždy jde o jednu ze čtyř příčin. Projít je v pořadí problém vyřeší bez sáhnutí po rozpouštědlech, která vytvářejí nové problémy.
Nejdřív: opravdu se nerozpouští?
Dej tomu čas. Úplné rozpuštění lyofilizovaného koláče může trvat několik minut stání s občasným jemným kroužením. Koláč, který se nerozpustil za devadesát sekund, ještě není problém.
Neurychluj to třesením ani vortexováním. Smykové napětí a rozhraní vzduch–kapalina způsobují agregaci a zagregovaný peptid se skutečně nikdy nerozpustí — z problému na počkání bys udělal trvalý.
Příčina 1: pH je na izoelektrickém bodě
Zdaleka nejčastější. Při svém pI nenese peptid žádný čistý náboj, elektrostatické odpuzování držící molekuly od sebe zmizí a rozpustnost dosáhne minima.
Pravděpodobný směr odvoď ze sekvence:
| Složení sekvence | Pravděpodobné pI | Zkus |
|---|---|---|
| Převážně bazické — K, R, H | Vysoké | Zředěná kyselina octová (0,1–1 %) |
| Převážně kyselé — D, E | Nízké | Zředěný hydroxid amonný nebo hydrogenuhličitan amonný |
| Smíšené nebo neutrální | Blízko neutrálního | Voda obvykle funguje |
Přidej minimum, které funguje, a pak dořeď vodou na finální objem. Přidání koncentrované kyseliny nebo zásady přímo vytváří místní extrémy, které peptid poškodí, i když je finální hodnota v pořádku.
Příčina 2: je hydrofobní
Sekvence s vysokým podílem I, L, V, F, W, M nebo A se nemusí rozpustit ve vodě při žádném pH, protože není dost nabitého povrchu k udržení solvatace.
Standardním postupem je rozpustit v minimálním objemu organického rozpouštědla a pak doředit do vodného pufru:
- DMSO — nejúčinnější a nejrušivější. Drž finální koncentraci nízko; nad přibližně 0,5 % je ve většině buněčných systémů cytotoxický.
- Acetonitril nebo isopropanol — šetrnější, méně účinné.
- Řeď do vodné fáze pomalu s kroužením, nikdy naopak. Přidání vody do koncentrovaného organického roztoku způsobí vysrážení peptidu.
Příčina 3: koncentrace je příliš vysoká
Rozpustnost je konečná. Peptid rozpustný při 1 mg/ml nemusí být při 10 a volba malého objemu rozpouštědla pro jednoduchost výpočtu je běžným způsobem, jak se dostat nad limit.
Řešením je prostě víc rozpouštědla. Objem vol podle peptidu, ne podle matematiky.
Příčina 4: už zagregoval
Pokud se vialkou třáslo, opakovaně mrazila nebo špatně skladovala, agregace už mohla nastat. Agregáty jsou obecně nevratné: sonikace a teplo mohou zdánlivě pomoci rozbitím velkých částic na menší, ale nativní stav neobnoví a způsobí další poškození.
To je případ, kde je poctivou odpovědí, že materiál je znehodnocený.
Pořadí, ve kterém postupovat
- Počkej, jemně krouži. Několik minut.
- Přidej víc vody — sniž koncentraci na polovinu.
- Posuň pH pryč od pI, směrem, který naznačuje sekvence, s minimem kyseliny nebo zásady.
- Je-li sekvence silně hydrofobní, rozpusť v minimu DMSO a doreď.
- Skonči. Cokoli nad rámec toho peptid poškodí víc, než pomůže.
Náš článek o pH a rozpustnosti pokrývá chemii v pozadí, návod na rekonstituci standardní postup a článek o agregaci to, čemu se vyhnout už na začátku.
All products and information referenced are for in-vitro research and laboratory use only. Nothing here is medical advice, and no therapeutic claim is made or implied.