pH, rozpustnosť a stabilita peptidov
Väčšina zlyhaní rozpustnosti je peptid sediaci na svojom izoelektrickom bode. Väčšina okien stability je kompromis medzi deamidáciou a hydrolýzou.
pH peptidového roztoku nie je detail. Určuje, či sa peptid vôbec rozpustí, ako rýchlo degraduje a ktoré chemické reakcie ho môžu zničiť. Väčšina problémov s rozpustnosťou a prekvapivá časť problémov so stabilitou sa vracia k nemu.
Náboj a izoelektrický bod
Každá ionizovateľná skupina v peptide má pKa — pH, pri ktorom je z polovice protonovaná. Pod svojou pKa drží protón, nad ňou nie. Čistý náboj peptidu je súčtom cez všetky jeho skupiny a s pH sa plynulo mení.
Izoelektrický bod, pI, je pH, kde sa kladné a záporné náboje vyrovnajú a čistý náboj je nula. Toto je pH minimálnej rozpustnosti, lebo elektrostatické odpudzovanie, ktoré molekuly bežne drží od seba, zmizlo. Peptidy pri svojom pI precipitujú a peptid, ktorý sa nechce rozpustiť, tam veľmi často práve sedí.
Hrubý odhad zo sekvencie:
- Prevažne kyslé zvyšky (D, E) — nízke pI. Lepšie sa rozpúšťa v mierne zásaditom roztoku.
- Prevažne bázické zvyšky (K, R, H) — vysoké pI. Lepšie sa rozpúšťa v mierne kyslom roztoku.
- Zmiešané alebo neutrálne — zvyčajne sa rozpustí vo vode bez úpravy.
Bežná prax skúsiť zriedenú kyselinu octovú pri zle rozpustnom peptide je práve táto zásada v praxi: okyslenie posunie roztok preč od pI bázického peptidu a obnoví čistý kladný náboj.
Degradácia závislá od pH
Rôzne cesty rozkladu majú rôzne pH optimá, preto existuje okno stability, nie pravidlo „čím nižšie, tým lepšie”.
| Reakcia | Najrýchlejšia pri | Postihuje |
|---|---|---|
| Deamidácia | pH nad ~7 | Asparagín, glutamín |
| Kyslá hydrolýza | pH pod ~3 | Najmä väzby Asp-Pro a Asp-Gly |
| Preskupovanie disulfidov | pH nad ~7 | Peptidy s cysteínom |
| Oxidácia | Široké, horšie v zásaditom | Metionín, cysteín, tryptofán |
Všeobecným výsledkom je, že väčšina peptidov je najstabilnejšia niekde okolo pH 4 až 6 — dosť kyslo na potlačenie deamidácie a výmeny disulfidov, nie dosť kyslo na spustenie hydrolýzy.
Praktické dôsledky
- Čistá voda nie je v praxi neutrálna. Voda v rovnováhe s atmosférickým oxidom uhličitým má okolo pH 5,5, čo zhodou okolností spadá do priaznivého okna.
- Tlmivý roztok používaj, len keď to protokol vyžaduje. Pufer pri pH 7,4 je správny pre bunkový test a nesprávny pre skladovanie, lebo leží v rozsahu deamidácie.
- Bakteriostatická voda je mierne kyslá, čo je čiastočne dôvod, prečo vyhovuje viacdňovému skladovaniu.
- Fosfátové pufre sa pri mrazení posúvajú. Jedna zložka kryštalizuje skôr než druhá a pH sa v nezmrznutom podiele môže posunúť o viac než jednotku — dôvod alikvotovať namiesto opakovaného zmrazovania.
- Neupravuj pH pridaním koncentrovanej kyseliny alebo zásady priamo. Lokálne extrémy v mieste pridania spôsobujú poškodenie, aj keď je finálna hodnota v poriadku. Najprv rieď.
Skrátene
Skús najprv vodu. Ak sa peptid nerozpustí, posuň pH preč od jeho pI — zriedená kyselina octová pri bázických sekvenciách, zriedený hydroxid amónny pri kyslých — s použitím minima, ktoré funguje. Na skladovanie je mierne kyslé lepšie než neutrálne.
Náš návod na rekonštitúciu pokrýva postup a skladovanie a stabilita rozoberá cesty degradácie podrobnejšie.
Všetky uvádzané produkty a informácie sú určené výhradne na in-vitro výskum a laboratórne použitie. Nič z uvedeného nie je lekárska rada a nepredstavuje ani nenaznačuje žiadne terapeutické tvrdenie.