ESI frente a MALDI: espectrometría de masas para la identidad peptídica
La HPLC dice cuánto hay de una cosa. La espectrometría de masas dice qué es, y en un péptido largo esa es la pregunta más importante.
La HPLC dice cuánto hay de una cosa en el vial. No dice qué es esa cosa. La espectrometría de masas responde a la segunda pregunta y, en cualquier péptido de más de unos pocos residuos, es la más importante de las dos.
Por qué la identidad es una pregunta aparte
Un cromatograma muestra picos separados por hidrofobicidad. Un péptido al que le falta un residuo es químicamente muy parecido al producto completo y puede eluir casi al mismo tiempo, a veces bajo el mismo pico. La integración lo contará como producto.
A la espectrometría de masas no le importa la hidrofobicidad. Mide masa, y un residuo ausente cambia la masa entre 57 y 186 daltons según cuál sea. Esa diferencia no se pasa por alto.
ESI: ionización por electrospray
La muestra se disuelve y se pulveriza a través de una aguja a alto voltaje. El aerosol forma gotas cargadas; el disolvente se evapora hasta que los iones peptídicos quedan liberados en fase gaseosa.
El rasgo característico es la carga múltiple. Un péptido capta varios protones, así que una molécula de 4000 Da no aparece a m/z 4000 sino como una serie de picos: en torno a 2001 para [M+2H]2+, 1334 para [M+3H]3+, 1001 para [M+4H]4+, y así sucesivamente. El software deconvoluciona esa serie en una masa neutra.
Ventajas: alta exactitud, acoplamiento directo a la HPLC de modo que separación e identificación ocurren en una sola carrera (LC-MS), y la carga múltiple sitúa moléculas grandes al alcance de equipos con rango m/z limitado. Inconvenientes: sensibilidad a sales y tampones, y un espectro bruto ilegible sin deconvolución.
MALDI: desorción/ionización láser asistida por matriz
La muestra se cocristaliza con una matriz orgánica pequeña que absorbe a la longitud de onda del láser. Un pulso láser incide en el depósito; la matriz absorbe la energía y se vaporiza, arrastrando el péptido y transfiriéndole un protón.
El rasgo característico es la carga predominantemente única. Un péptido de 4000 Da aparece a m/z ≈ 4001. El espectro es directamente legible, sin deconvolución.
Ventajas: mucha mayor tolerancia a sales y tampones, espectros sencillos, rapidez, buen comportamiento con mezclas. Inconvenientes: exactitud de masa normalmente menor que los ESI modernos, y no se acopla a la cromatografía líquida con la misma fluidez.
Elegir entre ambas
| ESI | MALDI | |
|---|---|---|
| Estados de carga | Múltiples | Mayoritariamente único |
| Acoplamiento a HPLC | Sí, directo | No directo |
| Tolerancia a sales | Baja | Alta |
| Legibilidad del espectro | Requiere deconvolución | Directa |
| Uso típico | QC de rutina, LC-MS pureza más identidad | Confirmación rápida, muestras salinas |
En los certificados de péptidos de investigación, lo más común es ESI en configuración LC-MS, porque da pureza e identidad en una sola inyección.
Leer el resultado
El certificado debe indicar una masa teórica, calculada desde la secuencia, y una masa observada. Deben coincidir estrechamente; en un equipo bien ajustado, una coincidencia dentro de una fracción de dalton es normal, y la coincidencia al dalton es aceptable en QC de rutina.
Discrepancias frecuentes e informativas:
- +16 Da: oxidación, típicamente de metionina
- +1 Da: ácido libre donde se esperaba una amida C-terminal, o desamidación
- −18 Da: pérdida de agua, o una ciclación inesperada
- −57 a −186 Da: una secuencia de deleción, la masa del residuo ausente
- Aproximadamente el doble de la masa esperada: un dímero, a menudo unido por disulfuro
Un certificado que indica pureza sin confirmación de masa deja sin responder la pregunta central. En un péptido largo o modificado, esa omisión pesa más que un punto porcentual de pureza.
Nuestra guía de verificación de pureza cubre ambos métodos juntos, y la guía del certificado el documento en su conjunto.
All products and information referenced are for in-vitro research and laboratory use only. Nothing here is medical advice, and no therapeutic claim is made or implied.