ESI a MALDI: spektrometria mas dla tożsamości peptydu
HPLC mówi, ile jest jednej rzeczy. Spektrometria mas mówi, czym ona jest — a przy długim peptydzie to ważniejsze pytanie.
HPLC mówi, ile jest jednej rzeczy w fiolce. Nie mówi, czym ta rzecz jest. Spektrometria mas odpowiada na drugie pytanie i przy każdym peptydzie dłuższym niż kilka reszt jest z tych dwóch ważniejsza.
Dlaczego tożsamość to osobne pytanie
Chromatogram pokazuje piki rozdzielone według hydrofobowości. Peptyd pozbawiony jednej reszty jest chemicznie bardzo podobny do produktu pełnej długości i może eluować niemal w tym samym czasie — czasem pod tym samym pikiem. Całkowanie policzy go jako produkt.
Spektrometrii mas hydrofobowość nie obchodzi. Mierzy masę, a brakująca reszta zmienia masę o 57 do 186 daltonów, zależnie od tego, która to reszta. Tej różnicy nie da się przeoczyć.
ESI: jonizacja przez elektrorozpylanie
Próbkę rozpuszcza się i rozpyla przez igłę pod wysokim napięciem. Rozpylenie tworzy naładowane kropelki; rozpuszczalnik odparowuje, aż jony peptydu zostaną uwolnione do fazy gazowej.
Cechą charakterystyczną jest wielokrotny ładunek. Peptyd przyjmuje kilka protonów, więc cząsteczka 4000 Da pojawia się nie przy m/z 4000, lecz jako seria pików — około 2001 dla [M+2H]2+, 1334 dla [M+3H]3+, 1001 dla [M+4H]4+ i tak dalej. Oprogramowanie dekonwoluuje tę serię do jednej masy obojętnej.
Zalety: wysoka dokładność, bezpośrednie sprzężenie z HPLC, więc rozdział i identyfikacja odbywają się w jednej analizie (LC-MS), a wielokrotny ładunek udostępnia duże cząsteczki aparatom o ograniczonym zakresie m/z. Wady: wrażliwość na sole i bufory oraz nieczytelne bez dekonwolucji widmo surowe.
MALDI: laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą
Próbkę współkrystalizuje się z małą matrycą organiczną absorbującą przy długości fali lasera. Impuls lasera trafia w plamkę; matryca pochłania energię i odparowuje, unosząc peptyd i przekazując mu proton.
Cechą charakterystyczną jest przewaga pojedynczego ładunku. Peptyd 4000 Da pojawia się przy m/z ≈ 4001. Widmo jest czytelne wprost, bez dekonwolucji.
Zalety: znacznie większa tolerancja na sole i bufory, proste widma, szybkość, dobre radzenie sobie z mieszaninami. Wady: zwykle niższa dokładność masy niż w nowoczesnych ESI i brak równie płynnego sprzężenia z chromatografią cieczową.
Wybór między nimi
| ESI | MALDI | |
|---|---|---|
| Stany ładunkowe | Wielokrotne | Głównie pojedynczy |
| Sprzężenie z HPLC | Tak, bezpośrednie | Nie bezpośrednie |
| Tolerancja na sole | Niska | Wysoka |
| Czytelność widma | Wymaga dekonwolucji | Bezpośrednia |
| Typowe zastosowanie | Rutynowa kontrola, LC-MS czystość plus tożsamość | Szybkie potwierdzenie, próbki zasolone |
W certyfikatach peptydów badawczych najczęstsze jest ESI w konfiguracji LC-MS, bo daje czystość i tożsamość z jednego nastrzyku.
Czytanie wyniku
Certyfikat powinien podawać masę teoretyczną — obliczoną z sekwencji — i masę zmierzoną. Powinny się ściśle zgadzać; przy dobrze ustawionym aparacie zgodność w granicach ułamka daltona jest normą, a zgodność co do całego daltona jest akceptowalna w rutynowej kontroli.
Częste, wymowne rozbieżności:
- +16 Da — utlenienie, zwykle metioniny
- +1 Da — wolny kwas tam, gdzie oczekiwano amidu na końcu C, albo deamidacja
- −18 Da — utrata wody albo nieoczekiwana cyklizacja
- −57 do −186 Da — sekwencja delecyjna, masa brakującej reszty
- Około dwukrotność oczekiwanej masy — dimer, często połączony mostkiem disiarczkowym
Certyfikat podający czystość bez potwierdzenia masy zostawia centralne pytanie bez odpowiedzi. Przy długim lub zmodyfikowanym peptydzie to pominięcie waży więcej niż punkt procentowy czystości.
Nasz przewodnik po weryfikacji czystości omawia obie metody razem, a przewodnik po certyfikacie dokument jako całość.
All products and information referenced are for in-vitro research and laboratory use only. Nothing here is medical advice, and no therapeutic claim is made or implied.