Como ler um cromatograma de HPLC num certificado de péptido
A percentagem de pureza é um número derivado do traço. O traço mostra como se chegou a ele e se merece crédito.
O cromatograma é a parte de um certificado de análise que a maioria ignora e a que mais informação contém. A percentagem de pureza é um único número derivado dessa imagem; a imagem mostra como se chegou a ele e se merece crédito.
O que são os eixos
O eixo horizontal é o tempo — minutos desde a injeção. O eixo vertical é a resposta do detetor, normalmente absorvência UV a 214 nm (a ligação peptídica) ou 280 nm (resíduos aromáticos). Um traço sem eixos identificados não prova nada.
Tempo de retenção
A HPLC de fase reversa separa por hidrofobicidade. A coluna é apolar; a fase móvel começa maioritariamente aquosa e torna-se cada vez mais orgânica ao longo da corrida — tipicamente com acetonitrilo. Compostos hidrofílicos eluem cedo, hidrofóbicos tarde.
O tempo de retenção é reprodutível num dado método mas não transferível entre métodos. Por isso comparar o tempo de retenção do certificado de um fornecedor com o de outro nada diz se gradiente, coluna e caudal não coincidirem. O número tem sentido dentro de um laboratório, como controlo de consistência entre lotes.
Ler o pico principal
Como é um bom pico principal:
- Simétrico. Um pico que sobe e desce a ritmos semelhantes. A assimetria tem valor de diagnóstico — ver abaixo.
- Estreito face à corrida. Picos largos sugerem má condição de coluna, sobrecarga de amostra ou uma população heterogénea.
- Regresso a uma linha de base plana de ambos os lados. Se não regressar, a integração tem de adivinhar onde o pico acaba, e o valor de pureza herda essa suposição.
A cauda — um pico com uma longa rampa descendente — indica normalmente interações secundárias com a fase estacionária, muitas vezes com resíduos básicos. A frente alargada — uma rampa de subida lenta — indica normalmente sobrecarga de coluna. Um ombro, uma saliência no flanco do pico principal, é o que há a vigiar: tipicamente uma impureza coeluída que a integração incluiu no pico principal, inflacionando a pureza declarada.
Ler os picos de impureza
Onde uma impureza está importa tanto como o seu tamanho.
| Posição | Identidade provável |
|---|---|
| Muito perto do pico principal | Sequência de deleção ou variante de um resíduo — quimicamente semelhante, a mais difícil de remover |
| Ligeiramente antes | Mais hidrofílica: muitas vezes um fragmento truncado ou hidrolisado, ou uma forma oxidada |
| Muito depois | Mais hidrofóbica: cadeias desprotegidas de forma incompleta, dímeros |
| Logo no início (volume morto) | Sais, material não retido — normalmente não contabilizado |
Um cromatograma com um pico dominante e dois ou três vizinhos pequenos e bem separados é a imagem normal e honesta de um péptido purificado. Um cromatograma com um único pico e mais nada, numa sequência longa, merece uma pergunta.
Como se calcula a percentagem
A pureza por HPLC é percentagem de área: a área sob o pico principal a dividir pela área total sob todos os picos integrados. Daí decorrem duas coisas, ambas importantes:
- É relativa, não absoluta. Nada diz sobre contra-iões, água ou solvente residual — nenhum absorve no UV. Por isso o teor de péptido é um ensaio à parte.
- Depende da integração. Onde se traça a linha de base e onde se colocam os limites do pico altera o número. Por isso uma tabela de integração com tempos de retenção e áreas vale mais do que a imagem sozinha, e muito mais do que a percentagem isolada.
O que pedir
Uma imagem do cromatograma, uma tabela de integração, as condições do método (coluna, gradiente, caudal, comprimento de onda de deteção) e o número de lote a que a corrida corresponde. Um laboratório que fez a análise tem os quatro.
O nosso guia do certificado cobre o resto do documento, e teor versus pureza o que a percentagem deixa de fora.
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