Um péptido que não dissolve: diagnóstico por ordem
Quase sempre uma de quatro causas. Percorrê-las por ordem resolve sem recorrer a solventes que criam problemas novos.
Um péptido que não dissolve é o problema prático mais frequente no laboratório, e é quase sempre uma de quatro causas. Percorrê-las por ordem resolve a situação sem recorrer a solventes que criam problemas novos.
Primeiro: não está mesmo a dissolver?
Dê tempo. A dissolução completa de um bolo liofilizado pode exigir vários minutos de repouso com rotação suave ocasional. Um bolo que não dissolveu em noventa segundos ainda não é um problema.
Não acelere sacudindo nem vortexando. Corte e interfaces ar-líquido causam agregação, e um péptido agregado nunca dissolverá de facto — teria transformado um problema de espera num permanente.
Causa 1: o pH está no ponto isoelétrico
De longe a mais frequente. No seu pI um péptido não tem carga líquida, desaparece a repulsão eletrostática que separa as moléculas e a solubilidade atinge o mínimo.
Deduza a direção provável a partir da sequência:
| Composição da sequência | pI provável | Experimentar |
|---|---|---|
| Sobretudo básica — K, R, H | Alto | Ácido acético diluído (0,1–1 %) |
| Sobretudo ácida — D, E | Baixo | Hidróxido de amónio ou bicarbonato de amónio diluídos |
| Mista ou neutra | Perto do neutro | A água costuma chegar |
Adicionar o mínimo que resulte e depois diluir com água até ao volume final. Adicionar ácido ou base concentrados diretamente cria extremos locais que danificam o péptido mesmo que a leitura final esteja correta.
Causa 2: é hidrofóbico
Uma sequência com alta proporção de I, L, V, F, W, M ou A pode não dissolver em água a nenhum pH, por não haver superfície carregada suficiente para a manter solvatada.
A abordagem padrão é dissolver num volume mínimo de solvente orgânico e depois diluir no tampão aquoso:
- DMSO — o mais eficaz e o mais perturbador. Manter a concentração final baixa; acima de cerca de 0,5 % é citotóxico na maioria dos sistemas celulares.
- Acetonitrilo ou isopropanol — mais suaves, menos eficazes.
- Diluir para dentro da fase aquosa devagar e com rotação, nunca ao contrário. Adicionar água a uma solução orgânica concentrada faz precipitar o péptido.
Causa 3: a concentração é demasiado alta
A solubilidade é finita. Um péptido que dissolve a 1 mg/ml pode não dissolver a 10, e escolher um volume pequeno de solvente por conveniência de cálculo é uma forma comum de ultrapassar o limite.
A solução é simplesmente mais solvente. Escolher o volume pelo péptido, não pelas contas.
Causa 4: já agregou
Se o frasco foi sacudido, congelado e descongelado ou mal conservado, a agregação pode já ter ocorrido. Os agregados são em geral irreversíveis: sonicação e calor podem parecer ajudar ao partir partículas grandes em menores, mas não restauram o estado nativo e causam mais dano.
É o caso em que a resposta honesta é que o material está comprometido.
A ordem a seguir
- Esperar, rodando suavemente. Vários minutos.
- Adicionar mais água — reduzir a concentração para metade.
- Afastar o pH do pI, na direção que a sequência indicar, com o mínimo de ácido ou base.
- Se a sequência for muito hidrofóbica, dissolver num mínimo de DMSO e diluir.
- Parar. Tudo além disto danifica o péptido mais do que ajuda.
O nosso artigo sobre pH e solubilidade cobre a química subjacente, o guia de reconstituição o procedimento padrão, e o artigo sobre agregação o que evitar desde o início.
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