HPLC und Massenspektrometrie: wie Peptidreinheit geprüft wird

6. 8. 2026 ·4 Min. Lesezeit · Zuletzt geprüft 28. 8. 2026

„99 % Reinheit” steht auf nahezu jedem Peptid-Angebot im Internet. Die Zahl ist bedeutungslos, solange man nicht weiß, wie sie zustande kam. Dieser Artikel behandelt die beiden Analysemethoden hinter einer glaubwürdigen Reinheitsangabe, was jede von ihnen leisten kann und was nicht — und warum beide nötig sind.

Das zugrunde liegende Problem

Die Festphasen-Peptidsynthese baut eine Kette Rest für Rest auf. Jeder Kupplungsschritt ist effizient, aber nicht perfekt. Über eine Sequenz von 30 Resten summieren sich kleine Fehlerraten pro Schritt zu einem Produktgemisch aus der Zielsequenz und einer Familie eng verwandter Nebenprodukte — Ketten, denen ein Rest fehlt, Ketten mit unvollständiger Entschützung, oxidierte Varianten.

Die Aufreinigung entfernt das meiste davon. Die Analyse zeigt, wie viel entfernt wurde und was übrig bleibt.

HPLC: wie viel

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie presst eine gelöste Probe unter Druck durch eine gepackte Säule. Die Bestandteile wandern unterschiedlich schnell, je nachdem wie stark sie mit dem Säulenmaterial wechselwirken, und treten daher zeitlich getrennt aus. Ein Detektor am Ausgang registriert, was passiert, und erzeugt ein Chromatogramm.

Für Peptide ist die Umkehrphasen-HPLC Standard: eine unpolare Säule mit einem Wasser/Acetonitril-Gradienten, die primär nach Hydrophobizität trennt. Detektiert wird meist über UV-Absorption bei etwa 214 nm, wo die Peptidbindung selbst absorbiert.

Die Reinheit wird als Fläche des Hauptpeaks geteilt durch die Gesamtfläche aller Peaks angegeben. Sie richtig zu lesen bedeutet, über die Schlagzeilenzahl hinauszuschauen:

• Auflösung. Zwei Verbindungen, die gemeinsam eluieren, erscheinen als ein Peak. Eine Deletionssequenz, die sich um einen einzigen Rest unterscheidet, kann sehr schwer abzutrennen sein — und wird, wenn sie nicht aufgelöst wird, als Produkt gezählt.
• Detektionswellenlänge. UV bei 214 nm erfasst das Peptidrückgrat und damit die meisten peptidischen Verunreinigungen. Nicht-peptidische Kontaminanten wie Restsalze absorbieren kaum oder gar nicht und sind für die Methode unsichtbar.
• Gradientenlänge. Ein kurzer, steiler Gradient läuft schnell, trennt aber schlecht. Ein flacher Gradient trennt besser.

Die entscheidende Einschränkung: Die HPLC identifiziert nichts. Sie zeigt, dass eine Komponente das Gemisch dominiert. Sie kann Ihnen nicht sagen, dass diese Komponente das bestellte Peptid ist.

Massenspektrometrie: welches Molekül

Die Massenspektrometrie ionisiert die Probe und misst das Masse-zu-Ladung-Verhältnis, wodurch die Molekülmasse direkt bestimmt wird. In der Peptidarbeit sind Elektrospray-Ionisation (ESI-MS) und MALDI-TOF die üblichen Methoden.

Die Prüfung ist unkompliziert: Berechnen Sie die theoretische monoisotopische oder mittlere Masse aus der Sequenz und vergleichen Sie sie mit der gemessenen Masse. Übereinstimmung innerhalb der Gerätegenauigkeit bestätigt die Identität.

Häufige Abweichungen sind aufschlussreich, nicht zufällig:

• −18 Da — Wasserverlust, oft Zyklisierung oder Dehydratation.
• +16 Da — Anlagerung eines Sauerstoffatoms, typischerweise Oxidation von Methionin.
• +1 Da — Deamidierung von Asparagin oder Glutamin.
• Eine Lücke in Höhe einer Restmasse — eine Deletionssequenz, bei der eine Aminosäure nicht gekuppelt wurde.

Auch die Massenspektrometrie hat einen blinden Fleck: Sie misst die Masse, nicht die Reihenfolge der Sequenz. Zwei Peptide mit gleicher Aminosäurezusammensetzung in unterschiedlicher Reihenfolge haben identische Masse. Sie zu unterscheiden erfordert Tandem-MS (MS/MS), die das Molekül fragmentiert und die Sequenz aus dem Fragmentmuster abliest.

Warum beide zusammen

Die beiden Methoden beantworten unterschiedliche Fragen, und keine reicht allein:

• HPLC allein: „eine Komponente dominiert” — aber welche?
• MS allein: „die Zielverbindung ist vorhanden” — aber in welchem Anteil?
• Zusammen: „die dominierende Komponente ist die Zielverbindung, in dieser Reinheit.”

Ein Lieferant, der nur einen Reinheitsprozentsatz ohne Massenbestätigung angibt, liefert Ihnen das halbe Bild. In der Praxis werden die Analysen häufig direkt als LC-MS gekoppelt, sodass jeder getrennte Peak beim Eluieren massenspektrometrisch identifiziert werden kann.

Über Reinheit und Identität hinaus

Für Arbeiten mit Zellkulturen sind zwei weitere Prüfungen relevant:

Die Endotoxinprüfung weist bakterielles Lipopolysaccharid nach, das schon in extrem niedrigen Konzentrationen starke biologische Reaktionen auslösen und Ergebnisse so verfälschen kann, dass sie wie ein echter Effekt aussehen.

Die Peptidgehaltsanalyse quantifiziert, welcher Anteil der lyophilisierten Masse tatsächlich Peptid ist — im Unterschied zu Restwasser und Gegenionen wie Trifluoracetat oder Acetat. Eine mit 5 mg beschriftete Flasche bezieht sich auf die Bruttomasse des Lyophilisats, sofern nichts anderes angegeben ist; der Netto-Peptidgehalt liegt typischerweise darunter. Für quantitative Arbeiten ist diese Unterscheidung nicht akademisch.

Was Sie einen Lieferanten fragen sollten

Drei Fragen trennen dokumentiertes Material von einer Behauptung:

1. Welches Labor hat die Analyse durchgeführt, und ist es vom Verkäufer unabhängig?
2. Umfasst der Bericht sowohl die HPLC-Reinheit als auch die massenspektrometrische Identität?
3. Stimmt die Chargennummer im Bericht mit der Chargennummer auf meiner Flasche überein?

Jede von uns gelieferte Charge wird von Janoshik Analytical analysiert, einem unabhängigen Drittlabor — auf HPLC-Reinheit, massenspektrometrische Identität, Endotoxine und Schwermetalle. Chargenbezogene Zertifikate sind auf Anfrage erhältlich; Details in unseren FAQ oder im Katalog.

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