ESI verzus MALDI: hmotnostná spektrometria pre identitu peptidu
HPLC povie, koľko jednej veci je prítomné. Hmotnostná spektrometria povie, čo to je — a pri dlhom peptide je to dôležitejšia otázka.
HPLC povie, koľko jednej veci je vo fľaštičke. Nepovie, čo tá vec je. Hmotnostná spektrometria odpovedá na druhú otázku a pri akomkoľvek peptide dlhšom než pár zvyškov je z tých dvoch dôležitejšia.
Prečo je identita samostatná otázka
Chromatogram ukazuje píky oddelené podľa hydrofobicity. Peptid s jedným chýbajúcim zvyškom je chemicky veľmi podobný produktu plnej dĺžky a môže eluovať takmer v rovnakom čase — niekedy pod tým istým píkom. Integrácia ho započíta ako produkt.
Hmotnostnú spektrometriu hydrofobicita nezaujíma. Meria hmotnosť a chýbajúci zvyšok mení hmotnosť o 57 až 186 daltonov podľa toho, ktorý to je. Tento rozdiel sa prehliadnuť nedá.
ESI: elektrosprejová ionizácia
Vzorka sa rozpustí a nastrekne cez ihlu s vysokým napätím. Sprej tvorí nabité kvapôčky; rozpúšťadlo sa odparuje, kým sa peptidové ióny neuvoľnia do plynnej fázy.
Charakteristickým znakom je viacnásobné nabitie. Peptid zachytí niekoľko protónov, takže molekula s 4000 Da sa neobjaví pri m/z 4000, ale ako séria píkov — zhruba pri 2001 pre [M+2H]2+, 1334 pre [M+3H]3+, 1001 pre [M+4H]4+ a tak ďalej. Softvér túto sériu dekonvolvuje na jednu neutrálnu hmotnosť.
Výhody: vysoká presnosť, priame napojenie na HPLC, takže separácia aj identifikácia prebehnú v jednom behu (LC-MS), a viacnásobné nabitie sprístupní veľké molekuly prístrojom s obmedzeným rozsahom m/z. Nevýhody: citlivosť na soli a tlmivé roztoky a surové spektrum nie je bez dekonvolúcie čitateľné.
MALDI: laserová desorpcia/ionizácia za asistencie matrice
Vzorka sa spolukryštalizuje s malou organickou matricou absorbujúcou pri vlnovej dĺžke lasera. Laserový pulz zasiahne škvrnu; matrica pohltí energiu a odparí sa, unesie peptid so sebou a prenesie protón.
Charakteristickým znakom je prevažne jednonásobné nabitie. Peptid s 4000 Da sa objaví pri m/z ≈ 4001. Spektrum je priamo čitateľné bez dekonvolúcie.
Výhody: oveľa vyššia tolerancia voči soliam a pufrom, jednoduché spektrá, rýchlosť, dobre zvláda zmesi. Nevýhody: zvyčajne nižšia presnosť hmotnosti než moderné ESI prístroje a nenapája sa na kvapalinovú chromatografiu tak plynulo.
Voľba medzi nimi
| ESI | MALDI | |
|---|---|---|
| Nábojové stavy | Viacnásobné | Väčšinou jednonásobné |
| Napojenie na HPLC | Áno, priame | Nie priame |
| Tolerancia solí | Nízka | Vysoká |
| Čitateľnosť spektra | Vyžaduje dekonvolúciu | Priama |
| Typické použitie | Rutinná QC, LC-MS čistota plus identita | Rýchle potvrdenie, slané vzorky |
Pri certifikátoch výskumných peptidov je najbežnejšie ESI v konfigurácii LC-MS, lebo z jedného nástreku dáva čistotu aj identitu.
Čítanie výsledku
Certifikát by mal uvádzať teoretickú hmotnosť — vypočítanú zo sekvencie — a nameranú hmotnosť. Mali by sa tesne zhodovať; pri dobre nastavenom prístroji je bežná zhoda v rámci zlomku daltonu a pre rutinnú QC je prijateľná zhoda na celý dalton.
Bežné výpovedné odchýlky:
- +16 Da — oxidácia, typicky metionínu
- +1 Da — voľná kyselina tam, kde sa očakával amid na C-konci, alebo deamidácia
- −18 Da — strata vody alebo neočakávaná cyklizácia
- −57 až −186 Da — delečná sekvencia, hmotnosť chýbajúceho zvyšku
- Zhruba dvojnásobok očakávanej hmotnosti — dimér, často spojený disulfidom
Certifikát uvádzajúci čistotu bez potvrdenia hmotnosti necháva ústrednú otázku bez odpovede. Pri dlhom alebo modifikovanom peptide je toto vynechanie dôležitejšie než percentuálny bod čistoty.
Náš sprievodca overovaním čistoty pokrýva obe metódy spolu a sprievodca certifikátom dokument ako celok.
Všetky uvádzané produkty a informácie sú určené výhradne na in-vitro výskum a laboratórne použitie. Nič z uvedeného nie je lekárska rada a nepredstavuje ani nenaznačuje žiadne terapeutické tvrdenie.