ESI i MALDI: masena spektrometrija peptida
HPLC kaže koliko je jedne stvari u bočici, ne što je ta stvar. Dvije metode koje odgovaraju na drugo pitanje i kako čitati odstupanja mase.
HPLC vam kaže koliko je jedne stvari u bočici. Ne kaže vam što je ta stvar. Masena spektrometrija odgovara na drugo pitanje i kod svakog peptida duljeg od nekoliko ostataka važnija je od prvoga.
Zašto je identitet zasebno pitanje
Kromatogram pokazuje vrhove razdvojene po hidrofobnosti. Peptid kojemu nedostaje jedan ostatak kemijski je vrlo sličan proizvodu pune duljine i može izaći gotovo u isto vrijeme — katkad pod istim vrhom. Integracija će ga brojiti kao proizvod.
Masenu spektrometriju hidrofobnost ne zanima. Ona mjeri masu, a nedostajući ostatak mijenja masu za 57 do 186 daltona, ovisno o tome koji je. Ta se razlika ne može promašiti.
ESI: ionizacija elektroraspršenjem
Uzorak se otopi i raspršuje kroz iglu pod visokim naponom. Sprej tvori nabijene kapljice; otapalo isparava dok se peptidni ioni ne oslobode u plinovitu fazu.
Značajka koja je obilježava jest višestruko nabijanje. Peptid prima nekoliko protona, pa se molekula od 4000 Da ne pojavljuje pri m/z 4000, nego kao niz vrhova — oko 2001 za [M+2H]2+, 1334 za [M+3H]3+, 1001 za [M+4H]4+ i tako dalje. Programska podrška taj niz dekonvoluira u jednu neutralnu masu.
Prednosti: visoka točnost, izravno se spaja s HPLC-om pa se razdvajanje i identifikacija odvijaju u jednoj analizi (LC-MS), a višestruko nabijanje velike molekule dovodi u domet instrumenata ograničenog raspona m/z. Nedostaci: osjetljiva je na soli i pufere, a sirovi se spektar ne može čitati bez dekonvolucije.
MALDI: laserska desorpcija/ionizacija uz matricu
Uzorak se sukristalizira s malim organskim spojem matrice koji apsorbira pri valnoj duljini lasera. Laserski impuls pogađa mjesto; matrica upija energiju i isparava, noseći peptid sa sobom i prenoseći mu proton.
Značajka koja je obilježava jest pretežno jednostruko nabijanje. Peptid od 4000 Da pojavljuje se pri m/z ≈ 4001. Spektar je izravno čitljiv, bez dekonvolucije.
Prednosti: daleko podnošljivija prema solima i puferima, jednostavni spektri, brza, dobro radi na smjesama. Nedostaci: obično niža točnost mase od suvremenih ESI instrumenata i ne spaja se s tekućinskom kromatografijom na jednako neprimjetan način.
Odabir između njih
| ESI | MALDI | |
|---|---|---|
| Nabojna stanja | Višestruka | Uglavnom jednostruko |
| Spaja se s HPLC-om | Da, izravno | Ne izravno |
| Podnošljivost prema solima | Niska | Visoka |
| Čitljivost spektra | Traži dekonvoluciju | Izravna |
| Uobičajena primjena | Rutinska kontrola, LC-MS čistoća uz identitet | Brza potvrda, slani uzorci |
Za certifikate istraživačkih peptida najčešća je ESI u LC-MS izvedbi, jer iz jednog injektiranja daje i čistoću i identitet.
Čitanje rezultata
Certifikat treba navesti teorijsku masu — izračunatu iz sekvence — i izmjerenu masu. Trebaju se blisko podudarati; za dobro podešen instrument uobičajeno je unutar djelića daltona, a podudaranje na najbliži cijeli dalton prihvatljivo je za rutinsku kontrolu.
Uobičajena informativna odstupanja:
- +16 Da — oksidacija, obično metionina
- +1 Da — slobodna kiselina ondje gdje se očekivao amid na C-kraju, ili deamidacija
- −18 Da — gubitak vode ili neočekivana ciklizacija
- −57 do −186 Da — delecijska sekvenca, masa nedostajućeg ostatka
- Otprilike dvostruka očekivana masa — dimer, često povezan disulfidom
Certifikat koji pokazuje čistoću bez potvrde mase ostavlja središnje pitanje bez odgovora. Kod dugog ili modificiranog peptida taj izostanak znači više od jednog postotnog boda čistoće.
Naš vodič za provjeru čistoće pokriva obje metode zajedno, a vodič za certifikat dokument u cjelini.
All products and information referenced are for in-vitro research and laboratory use only. Nothing here is medical advice, and no therapeutic claim is made or implied.