pH, rozpustnost a stabilita peptidů
Většina selhání rozpustnosti je peptid sedící na svém izoelektrickém bodě. Většina oken stability je kompromis mezi deamidací a hydrolýzou.
pH peptidového roztoku není detail. Určuje, zda se peptid vůbec rozpustí, jak rychle degraduje a které chemické reakce ho mohou zničit. Většina problémů s rozpustností a překvapivá část problémů se stabilitou se vrací k němu.
Náboj a izoelektrický bod
Každá ionizovatelná skupina v peptidu má pKa — pH, při kterém je z poloviny protonovaná. Pod svou pKa drží proton, nad ní ne. Čistý náboj peptidu je součtem přes všechny jeho skupiny a s pH se plynule mění.
Izoelektrický bod, pI, je pH, kde se kladné a záporné náboje vyrovnají a čistý náboj je nula. To je pH minimální rozpustnosti, protože elektrostatické odpuzování, které molekuly běžně drží od sebe, zmizelo. Peptidy při svém pI precipitují a peptid, který se nechce rozpustit, tam velmi často právě sedí.
Hrubý odhad ze sekvence:
- Převážně kyselé zbytky (D, E) — nízké pI. Lépe se rozpouští v mírně zásaditém roztoku.
- Převážně bazické zbytky (K, R, H) — vysoké pI. Lépe se rozpouští v mírně kyselém roztoku.
- Smíšené nebo neutrální — obvykle se rozpustí ve vodě bez úpravy.
Běžná praxe zkusit zředěnou kyselinu octovou u špatně rozpustného peptidu je právě tato zásada v praxi: okyselení posune roztok pryč od pI bazického peptidu a obnoví čistý kladný náboj.
Degradace závislá na pH
Různé cesty rozkladu mají různá pH optima, proto existuje okno stability, ne pravidlo „čím níž, tím líp”.
| Reakce | Nejrychlejší při | Postihuje |
|---|---|---|
| Deamidace | pH nad ~7 | Asparagin, glutamin |
| Kyselá hydrolýza | pH pod ~3 | Zejména vazby Asp-Pro a Asp-Gly |
| Přeskupování disulfidů | pH nad ~7 | Peptidy s cysteinem |
| Oxidace | Široké, horší v zásaditém | Methionin, cystein, tryptofan |
Obecným výsledkem je, že většina peptidů je nejstabilnější někde kolem pH 4 až 6 — dost kysele na potlačení deamidace a výměny disulfidů, ne dost kysele na spuštění hydrolýzy.
Praktické důsledky
- Čistá voda není v praxi neutrální. Voda v rovnováze s atmosférickým oxidem uhličitým má kolem pH 5,5, což shodou okolností spadá do příznivého okna.
- Pufr používej, jen když to protokol vyžaduje. Pufr při pH 7,4 je správný pro buněčný test a nesprávný pro skladování, protože leží v rozsahu deamidace.
- Bakteriostatická voda je mírně kyselá, což je částečně důvod, proč vyhovuje vícedennímu skladování.
- Fosfátové pufry se při mrazení posouvají. Jedna složka krystalizuje dřív než druhá a pH se v nezmrzlém podílu může posunout o víc než jednotku — důvod alikvotovat místo opakovaného zmrazování.
- Neupravuj pH přidáním koncentrované kyseliny nebo zásady přímo. Místní extrémy v místě přidání způsobují poškození, i když je finální hodnota v pořádku. Nejdřív řeď.
Zkráceně
Zkus nejdřív vodu. Nerozpustí-li se peptid, posuň pH pryč od jeho pI — zředěná kyselina octová u bazických sekvencí, zředěný hydroxid amonný u kyselých — s použitím minima, které funguje. Ke skladování je mírně kyselé lepší než neutrální.
Náš návod na rekonstituci pokrývá postup a skladování a stabilita rozebírá cesty degradace podrobněji.
All products and information referenced are for in-vitro research and laboratory use only. Nothing here is medical advice, and no therapeutic claim is made or implied.