Syntéza peptidov na pevnej fáze, vysvetlená
Merrifieldova metóda vysvetľuje väčšinu toho, čo je na certifikáte analýzy: delečné sekvencie, prečo čistota klesá s dĺžkou a prečo cena rastie tak, ako rastie.
Syntéza peptidov na pevnej fáze je dôvodom, prečo môže katalóg výskumných peptidov vôbec existovať. Zhruba pochopiť, ako funguje, vysvetľuje väčšinu toho, čo sa objavuje na certifikáte analýzy — prečo existujú delečné sekvencie, prečo čistota klesá s dĺžkou a prečo niektoré zlúčeniny stoja niekoľkonásobne viac než iné s rovnakou hmotnosťou.
Základná myšlienka
Pred rokom 1963 sa peptidy stavali v roztoku, čo znamenalo purifikovať medziprodukt po každom jednom kroku. Bruce Merrifield prišiel s tým, že rastúci reťazec ukotví na nerozpustnú živicovú guľôčku. Reťazec zostane na mieste; reagencie a vedľajšie produkty sa vymyjú. Purifikácia medzi krokmi sa stane filtráciou a to, čo trvalo mesiace, sa dá zvládnuť za dni. Práca získala v roku 1984 Nobelovu cenu.
Cyklus
Reťazce sa stavajú od C-konca k N-koncu — opačne, než sa sekvencie zapisujú a než pracujú ribozómy. Každý zvyšok si vyžaduje štyri kroky:
- Odchránenie. Odstránenie dočasnej chrániacej skupiny z voľného konca reťazca.
- Premytie.
- Naviazanie. Pridanie ďalšej aminokyseliny, tiež chránenej, s činidlom aktivujúcim jej karboxylovú skupinu.
- Premytie.
Opakuje sa na každý zvyšok. Na konci sa hotový reťazec odštiepi zo živice a odstránia sa chrániace skupiny bočných reťazcov — zvyčajne kyselinou trifluóroctovou, odkiaľ pochádzajú TFA protiióny vo finálnom produkte.
Prečo dĺžka stojí čistotu
Každý spojovací krok je účinný, ale nie dokonalý. Predpokladajme 99,5 % dokončenie na krok — dobrá hodnota. Po celej sekvencii sa to znásobí:
| Zvyškov | Surový výťažok plnej dĺžky pri 99,5 %/krok |
|---|---|
| 5 | ~98 % |
| 10 | ~96 % |
| 20 | ~91 % |
| 30 | ~86 % |
| 50 | ~78 % |
Chýbajúci podiel nie je odpad — je to populácia veľmi príbuzných molekúl, väčšinou reťazcov s jedným chýbajúcim zvyškom. To sú delečné sekvencie a sú dôvodom, prečo existuje purifikácia a prečo má chromatogram vedľajšie píky blízko toho hlavného.
Vysvetľuje to aj ceny. Tripeptid a 30-zvyškový peptid nie sú v cene desaťnásobne od seba; sú ďalej, lebo ten dlhší potrebuje viac krokov, dáva ťažšie deliteľnú zmes a nižší výťažok.
Fmoc a Boc
Dominujú dve stratégie chrániacich skupín. Fmoc chémia používa skupinu labilnú voči zásadám, odstraňovanú piperidínom, a finálne štiepenie pomocou TFA — je štandardom väčšiny komerčnej syntézy. Boc chémia používa chránenie labilné voči kyselinám a na finálne štiepenie vyžaduje fluorovodík, čo si žiada špeciálne vybavenie. Boc prežíva pri náročných sekvenciách, kde Fmoc zlyháva.
Čo to vysvetľuje na certifikáte
- Vedľajšie píky blízko hlavného — delečné sekvencie, štruktúrne podobné a ťažko oddeliteľné.
- TFA protiióny — zo štiepiaceho kroku a dôvod, prečo je obsah peptidu nižší než hmotnosť vo fľaštičke.
- Prečo čítať tvrdenia o čistote s ohľadom na dĺžku — 99 % pri tripeptide a 99 % pri 30-zvyškovom peptide nie sú rovnako pôsobivé výsledky.
- Prečo potvrdenie hmotnosti najviac záleží pri dlhých sekvenciách — tam je delécia najpravdepodobnejšia a chromatograficky najhoršie viditeľná.
Náš sprievodca overovaním čistoty rozoberá HPLC a hmotnostnú spektrometriu a poznámka o obsahu verzus čistote to, čo fľaštička skutočne obsahuje.
Všetky uvádzané produkty a informácie sú určené výhradne na in-vitro výskum a laboratórne použitie. Nič z uvedeného nie je lekárska rada a nepredstavuje ani nenaznačuje žiadne terapeutické tvrdenie.