Disulfidne veze i ciklički peptidi
Jedina poprečna veza koja nastaje spontano — zašto preslagivanje masena spektrometrija ne vidi i zašto su laktami stabilniji.
Disulfidna veza jedina je kovalentna poprečna veza koja u peptidu nastaje spontano i razlog je zašto su neke sekvence daleko teže za proizvodnju, provjeru i čuvanje nego što bi njihova duljina sama sugerirala.
Što je to
Dva cisteinska ostatka svaki nosi tiolnu skupinu, –SH. U oksidirajućim uvjetima dva se atoma sumpora povežu i izgube se dva vodika: rezultat je kovalentna S–S veza koja spaja dva dijela lanca.
Promjena mase iznosi −2 Da po vezi u odnosu na reducirani oblik. Ta mala razlika način je na koji masena spektrometrija potvrđuje prisutnost disulfida — i zato certifikat treba navesti koji je oblik mjeren.
Zašto je strukturno važna
Većinu peptidne strukture drže slabe, reverzibilne sile. Disulfid je kovalentna veza, red ili dva veličine jača, i trajno ograničava konformaciju. Kod mnogih peptida disulfid jest aktivna struktura: reducirajte ga i aktivnost nestaje iako je svaka aminokiselina i dalje prisutna, a sekvenca nepromijenjena.
Zato brojka o čistoći sama može zavarati kod peptida s cisteinom. HPLC može pokazati jedan čist vrh; je li disulfid nastao i je li nastao na pravom mjestu, zasebno je pitanje.
Proizvodni problem
S jednim parom cisteina moguća je jedna veza. S dva para moguća su tri sparivanja, od kojih je samo jedno ispravno. S tri para ima ih petnaest. Sinteza stoga koristi ortogonalne zaštitne skupine — različiti cisteini nose različitu zaštitu, koja se uklanja redom, pa svaka veza nastaje namjerno, a ne nasumično.
To dodaje korake, trošak i prilike za pogrešku i znatan je dio razloga zašto se peptidi s cisteinom cijene iznad svoje duljine.
Preslagivanje i dimerizacija
Dva povezana otkazivanja pogađaju čuvanje:
- Preslagivanje — postojeći disulfid mijenja partnere i nastaje izomer iste mase i istog aminokiselinskog sastava, ali pogrešne strukture. Masena ga spektrometrija ne može razlikovati. HPLC često može, kao pomaknut ili dodatni vrh.
- Dimerizacija — cistein jedne molekule veže se na cistein druge, dajući vrstu otprilike dvostruke očekivane mase. Ovo je masenom spektrometrijom vidljivo.
Oboje ubrzava lužnati pH, jer izmjena tiol–disulfid ide preko deprotoniranog tiolata. Iznad otprilike pH 7 brzina naglo raste. Čuvanje peptida s disulfidom u neutralnom ili lužnatom puferu jedna je od lakše izbježivih pogrešaka u stabilnosti.
Ciklizacija izvan disulfida
Nije svaki prsten disulfid. Laktamski mostovi — amid između amina bočnog ogranka lizina i karboksila bočnog ogranka aspartata ili glutamata — česti su u osmišljenim analozima. Melanotan II standardni je primjer. Laktami su daleko stabilniji od disulfida: ne preslažu se, ne reduciraju se i nisu pH-labilni na isti način. Masena je oznaka −18 Da, voda izgubljena pri nastanku amida.
Ciklizacija glava-rep spaja N-kraj s C-krajem, uklanjajući oba kraja, a s njima i svaki put egzopeptidaza.
Praktično rukovanje
- Čuvajte blago kiselo, oko pH 4–6. Izbjegavajte neutralne ili lužnate pufere za čuvanje.
- Izbjegavajte redukcijska sredstva — DTT, TCEP, β-merkaptoetanol — osim ako je redukcija namjera.
- Smanjite prostor iznad tekućine: otopljeni kisik pokreće i oksidaciju i izmjenu.
- Držite umjerenu koncentraciju; dimerizacija ovisi o koncentraciji.
- Provjerite na certifikatu masu koja odgovara oksidiranom obliku i imajte na umu da masa sama ne može isključiti preslagivanje.
Naš članak o pH i stabilnosti pokriva kemiju izmjene, a vodič za provjeru čistoće što HPLC i masena spektrometrija svaka utvrđuju.
All products and information referenced are for in-vitro research and laboratory use only. Nothing here is medical advice, and no therapeutic claim is made or implied.